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1806 年，23 歲的德國藥劑師 Sertürner 從罌粟中首次分離出單體嗎啡，現(xiàn)代天然藥物化學研究自此起步。在此基礎上，德國化學家 Friedrich Wǒhler 在 1828 年成功實現(xiàn)了尿素的人工合成，這也標志著有機化學學科的正式誕生。可以說，正是人類對生物活性天然產(chǎn)物 (natural product, NPs) 的持續(xù)研究促成了有機化學學科的建立。

所謂生物活性天然產(chǎn)物 (NPs) ，其實是自然界長期進化的物質實體，是生物活性物質和實用藥物研發(fā)的重要源泉。在藥物研發(fā)進程中，NPs 對于癌癥和傳染病治療藥物的創(chuàng)新有著巨大貢獻。但時至今日，NPs 仍在篩選、分離、表征、優(yōu)化等各方面存在技術障礙。其中，從復雜混合物中分離 NPs 可謂是最為嚴峻的挑戰(zhàn)之一，這也成為了藥物研究的一大瓶頸。

為了解決這一瓶頸， 中南大學湘雅醫(yī)院藥學部劉韶教授團隊，創(chuàng)新性地建立了一種可全面挖掘天然藥物藥效成分的整合分子網(wǎng)絡框架 (integrated molecular networking workflow for NP dereplication, IMN4NPD)，不僅加快了分子網(wǎng)絡中廣泛集群的去復制 (dereplication)，而且對現(xiàn)有研究方法中經(jīng)常被忽略的自循環(huán)與成對節(jié)點提供標注。相關研究成果日前被發(fā)表于美國化學會 (ACS) 期刊 Analytical Chemistry。

論文地址：
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04746

IMN4NPD：集成多種計算工具，由光譜相似度驅動的分子網(wǎng)絡
IMN4NPD 的核心工作原理是由光譜相似度驅動的分子網(wǎng)絡。它通過集成并協(xié)同 NPClassifier, molDiscovery 和 t-SNE 網(wǎng)絡等多種計算工具，從而幫助研究人員快速識別特定類別的化合物，同時還能簡化分子網(wǎng)絡節(jié)點中的標注。
* NPClassifier：一種基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡的天然產(chǎn)物結構分類工具
* molDiscovery：一種質譜數(shù)據(jù)庫搜索方法

一般而言，IMN4NPD 的工作流程可分為 3 步：

第一步，對原始 LC-MS 數(shù)據(jù)進行預處理，以生成分子網(wǎng)絡或基于特征的分子網(wǎng)絡。隨后，基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡的 NP 分類工具 SIRIUS，通過 NPClassifier 對復合類進行系統(tǒng)分類。

第二步，該研究通過 GNPS (Global Natural Product Social Molecular Networking)，進行了基于 MS/MS 光譜數(shù)據(jù)庫的去復制實驗，然后通過 molDiscovery 進行基于計算機數(shù)據(jù)庫的去復制。

第三步，研究人員利用 MS/MS 光譜特征的相似度生成 t-SNE 網(wǎng)絡，并對每個節(jié)點的化合物進行化學分類，以精確定位、并去復制分布在自循環(huán)網(wǎng)絡中的特定化合物類別。

IMN4NPD 工作流程示意圖

可用性評估：探索異喹啉類似物，在分子網(wǎng)絡中迅速識別特定化合物簇
為了評估 IMN4NPD 工作流程的性能和優(yōu)勢，該研究重新分析了蓮子心的乙醇提取物。蓮子心是蓮蓬中的胚芽部分，是一種富含雙芐基異喹啉、單芐基異喹啉和阿樸啡等多種生物堿的中藥植物，可用于治療失眠、遺精、心率失調、高血壓等癥狀。

基于實驗性 MS/MS 光譜數(shù)據(jù)庫，該研究最初對分子網(wǎng)絡中的單個節(jié)點進行化學分類，從而在分子網(wǎng)絡中迅速識別出特定的化合物簇，以探索新的異喹啉類似物。在查看了分子網(wǎng)絡中每個特征映射的化學分類結果后，研究人員發(fā)現(xiàn)，很容易就能找到與異喹啉類似物相對應的某些化合物簇，同時，異喹啉類化合物主要分布在分子網(wǎng)絡中的四個簇中。

異喹啉類化合物分布圖

該研究還發(fā)現(xiàn)，通過實驗性 MS/MS 光譜數(shù)據(jù)庫（如 GNPS 數(shù)據(jù)庫）只能成功地去復制大型簇中數(shù)量有限的特征。因此，該研究采用了最先進的硅學片段算法 molDiscovery 進行結構數(shù)據(jù)庫匹配。這種基于實驗和硅學 MS/MS 圖譜數(shù)據(jù)庫的去復制方法，增強了在分子網(wǎng)絡中、尤其是在大型集群中，及時、方便地標注物質結構的能力。

以單芐基異喹啉生物堿中的集群 A 為例，該集群由 36 個節(jié)點組成，其中 MS 數(shù)據(jù)庫只標注了 7 個節(jié)點，Structure 數(shù)據(jù)庫標注了 35 個節(jié)點，MS 和 Structure 數(shù)據(jù)庫同時標注了 8 個節(jié)點。值得注意的是，這其中有一個 m/z 344.1855 節(jié)點 (tR=7.6329) 被 MS 結構數(shù)據(jù)庫完全標注，這表明候選結構為 3′-O-methyl-4′-methoxy-N-methylcoclaurine（如上圖所示）。

通過進一步分析，該節(jié)點連續(xù)損失了 NH3CH3、CH3OH 和 H2O，隨后發(fā)生了環(huán)裂解、α 裂解和 β 裂解，分別在 m/z 107.0496、137.0597、151.0757、175.0750、205.1098、235.0752、267.1017、299.1271 和 312.1590 處產(chǎn)生碎片離子。

經(jīng) Structure 數(shù)據(jù)庫鑒定，m/z 448.1963（tR = 1.6287）的結點為 N-methylnorcoclaurine 7-O-glucoside。另一個 m/z 312.1593 (tR = 7.3621) 節(jié)點則顯示了包含 1 個單芐基異喹啉在內的四個候選結構。與 m/z 344.1855 節(jié)點 (tR=7.6329) 相比，該節(jié)點在 m/z 190.0862 (C11H12NO2) 處存在碎片離子，表明這是一個亞甲基二氧基。

研究結果：基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡，從 t-SNE 網(wǎng)絡的角度對比三大研究算法
與 MolNetEnhancer 相比，IMN4NPD 采用基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡的 NP 分類工具 NPClassifier，來單獨分類分子網(wǎng)絡中的每個特征，而不是整個簇或分子家族。該研究使用了改進過的余弦相似度計算相似矩陣，并以此生成 t-SNE 網(wǎng)絡。同時，該研究還通過 NPClassifier 基于每個節(jié)點的 MS/MS 光譜數(shù)據(jù)對其進行分類，并將這些分類映射到 t-SNE 網(wǎng)絡中。

在傳統(tǒng)的分子網(wǎng)絡觀點中，異喹啉一般由三個大簇 (簇 A-C) 和一個小簇 (簇 D) 共同組成。從 t-SNE 網(wǎng)絡的角度來看，很明顯，異喹啉的四個集群節(jié)點被緊密分組，形成了不同的集群區(qū)域。但值得注意的是，從 t-SNE 網(wǎng)絡的角度來看，分子網(wǎng)絡中的簇 A 可以進一步分為兩個更小的簇。此外，t-SNE 可以有效定位異喹啉類節(jié)點，從而大大減輕了相關節(jié)點的結構解析工作。

異喹啉在 t-SNE 圖譜中的四個聚類區(qū)域

修正余弦相似度方法面對多種學修飾的化合物光譜存在局限性，該研究還選擇了 Spec2Vec 和 MS2DeepScore 等相似度算法，并以此生成 t-SNE 網(wǎng)絡?；?Spec2Vec，異喹啉依然在分子網(wǎng)絡中形成四大簇區(qū)。

但基于 MS2DeepScore，異喹啉的大簇 A 和 B 的節(jié)點間隔很近，形成了幾個聚類區(qū)域，但大簇 C 中的節(jié)點分散在了整張圖中，這為后續(xù)分析帶來了挑戰(zhàn)。

多種光譜相似度算法生成的 t-SNE 圖譜比較

一個有趣的現(xiàn)象是，m/z 296.1646節(jié)點 (tR = 11.54) 在修正余弦相似度和 MS2DeepScore 相似度的 t-SNE 圖中，均遠離異喹啉相關的節(jié)點聚類區(qū)域，但在基于 Spec2Vec 光譜相似度的 t-SNE 圖中，該節(jié)點與大簇 A 的聚類區(qū)域相鄰。這類自換節(jié)點可能代表了一類異喹啉化合物，在進一步比較后可確認該節(jié)點是阿樸啡類生物堿。

因此，化合物化學分類和 t-SNE 網(wǎng)絡，可分別提供關于特征的不同信息，一定程度上減少了假陰性的出現(xiàn)。

此外，基于 Spec2Vec 光譜相似度的 t-SNE 網(wǎng)絡，大簇 A 附近存在 m/z 298.1438 (tR = 7.02) 和 m/z 298.1438 (tR = 7.60) 兩個節(jié)點，這兩個節(jié)點是分子網(wǎng)絡中的自換節(jié)點和對節(jié)點。盡管沒有被歸類為異喹啉化合物，但它們與異喹啉大簇 A 結構相似。進一步分析可知，m/z 298.1438 (tR = 7.02) 是一種已知的阿樸啡類生物堿——nornuciferidine，m/z 298.1438 (tR = 7.60) 也顯示出與 nuciferine 和 nornuciferidine 相類似的阿樸啡類生物堿。

通過對以上三個節(jié)點的研究發(fā)現(xiàn)，它們都屬于阿樸啡類生物堿，這與單芐基異喹啉類生物堿不同。在利用修正余弦相似度和 MS2DeepScore 相似度時，這三個節(jié)點遠離單芐基異喹啉類生物堿相關節(jié)點的聚類區(qū)域大簇 A，但基于 Spec2Vec，這三個節(jié)點卻可在大簇 A 附近被發(fā)現(xiàn)。

這種差異表明 Spec2Vec 光譜相似性在準確捕捉異喹啉類化合物相似結構方面的卓越能力。

人工智能在天然產(chǎn)物研究中的應用加速
近年來，受益于各種現(xiàn)代技術的迅猛發(fā)展，在天然生物活性分子的研究中涌現(xiàn)出了一大批基于 LC-MS/MS 和 NMR 技術，并集成生物信息學、代謝組學、計算機科學等多學科技術手段的新策略和新方法。尤其是，隨著人工智能和機器學習算法開始融入天然產(chǎn)物研究工作，進一步為研究人員帶來了新一輪的生產(chǎn)力革命。

最初，人工智能的應用集中在有機分子的數(shù)字化，以及使用降維技術繪制 NP 化學空間圖。后來，研究者通過開發(fā)機器學習二元分類器來預測 NP 的生物功能。如今，神經(jīng)網(wǎng)絡架構開始被用于基因組挖掘和分子設計，深度學習算法在藥物發(fā)現(xiàn)和分子信息學領域越來越受歡迎。

所以，我們可以看到，產(chǎn)學研各界近年來均加快了相關研究的步伐。2022 年，國家超級計算廣州中心就聯(lián)合中山大學、星藥科技、美國麻省理工學院和佐治亞理工學院，基于「天河二號」的強大計算和存儲能力，提出了一種深度學習驅動的生物逆合成路徑導航工具 BioNavi-NP。

而在企業(yè)界，天然產(chǎn)物的研究也在不斷加速。2023 年，天士力醫(yī)藥集團與華為云達成合作，雙方將結合天然產(chǎn)物現(xiàn)代化研究數(shù)據(jù)等，共建中醫(yī)藥領域垂直大模型。

然而，天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫仍然是科研進程中的一大挑戰(zhàn)。當前，全世界主流的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)存儲庫，包括生物合成基因簇的最小信息 (MIBiG)、天然產(chǎn)物圖譜 (NP 圖譜)、全球天然產(chǎn)物分子網(wǎng)絡 (GNPS)、天然產(chǎn)品磁共振數(shù)據(jù)庫 (NP-MRD) 等，但這些數(shù)據(jù)庫的覆蓋率較低，并且存在較為常見的數(shù)據(jù)錯誤問題，這些都阻礙了人工智能在天然產(chǎn)物藥物發(fā)現(xiàn)方面的進展。

近年來，中國科學家屠呦呦、日本科學家大村智和愛爾蘭科學家 William C. Campbell 等多位研究者因在天然產(chǎn)物全合成方面的成就獲得了諾貝爾化學獎提名。毫無疑問，隨著天然產(chǎn)物的重要性不斷凸顯，人工智能在天然產(chǎn)物研究方面的融合也即將按下加速鍵。

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